Biotecnologia na produção industrial de substâncias terapêuticas

A biotecnologia microbiana permite obter produtos com grande interesse na terapêutica. No quadro seguinte encontram-se alguns desses produtos.

Antibióticos	Produtos utilizados em baixas concentrações para inibir a multiplicação (bacteriostáticos) ou matar bactérias patogénicas que atacam o organismo (bactericidas). Para obtenção de antibióticos utiliza-se a bioconversão ou biotransformação, ou seja, utilização de microrganismos capazes de realizar reações químicas que vão além das substâncias essenciais ao seu desenvolvimento, e que são economicamente favoráveis. Inclui três fases: - Preparação do material – fracionamento, esterilização e engenharia genética; - Bioconversão – cultura de células num fermentador ou biorreator, fermentação, catálise enzimática e controlo de fermentadores; - Recuperação de produto – separação e rutura das células, concentração do produto, isolamento e purificação.
Esteroides	Biomoléculas muito importantes em variadas funções: processos metabólicos, processos inflamatórios, controlo de alergias e artrites, controlo da natalidade.
Vitaminas	Algumas vitaminas, com a B12 e a B2 são produzidas recorrendo a bactérias e a fungos, respetivamente. Para aumentar o rendimento da produção é possível: - Provocar mutações e selecionar os mutantes mais produtivos; - Fornecer aos microrganismos os nutrientes necessários; - Evitar a contaminação por outros microrganismos.
Proteínas humanas	Através das técnicas de DNA recombinante, é possível produzir proteínas humanas com microrganismos

A produção de proteínas recorre à técnica de DNA recombinante. Fica aqui um esquema resumo:

http://www.quia.com/files/quia/users/lmcgee/genetics/APchapter20_genetic_engineering/overviewgenecloning.gif

Alguns exemplos de proteínas produzidas através da biotecnologia:

Proteína	Aplicação
Fatores de coagulação do sangue	Tratamento de doenças que afetam a coagulação do sangue (ex: hemofilia)
Fatores de crescimento de colónias celulares	Tratamento do cancro como adjuvante de quimioterapia
Fator de crescimento da epiderme	Tratamento do cancro, feridas, úlceras e feridas da pele
Derivados de plaquetas	Tratamento de certos tipos de úlceras
Insulina	Tratamento de diabetes
Eritropoetina	Tratamento da anemia
Hormona de crescimento	Tratamento de anomalias no crescimento
Anticorpos monoclonais	Usos vários: utilização em reações in vitro para diagnóstico; utilização in vitro para vários tipos de doenças
Vacinas	Vacinação contra a hepatite B, malária, herpes e HIV (em estudo)
Interferão	Estimulação da resposta imunitária

Uma vacina produzida de forma tradicional contém bactérias ou vírus desativados ou atenuados. Desta forma, existem riscos associados: o agente patogénico pode voltar a ativar-se, é necessário produzir grandes quantidades de agente patogénico e manuseá-lo e a conservação requere substâncias que podem ser alergénicas.

As vacinas produzidas através da biotecnologia funcionam no mesmo princípio das vacinas tradicionais: estimular o nosso sistema imunitário , para que este esteja preparado quando for invadido por um agente patogénico.

Mas, ao contrário das vacinas tradicionais, não contêm quaisquer agentes patogénicos, o que as torna mais seguras, e poucas ou nenhumas substâncias adicionadas, sendo, por isso, mais puras.

Vacinas tradicionais vs vacinas produzidas recorrendo à biotecnologia

https://dannipanini.files.wordpress.com/2014/02/mbb-1-vaccine.png?w=560

Doenças e desequilíbrios: Imunodeficiência

Imunodeficiência corresponde a uma deficiência no sistema imunitário. A imunodeficiência pode ser dividida em dois tipos:

Imunodeficiência congénita

Refere-se a indivíduos que não possuem nem linfócitos T nem linfócitos B, causado por um funcionamento anormal da medula óssea.

Imunodeficiência adquirida

Tem como exemplo paradigmático a SIDA. O HIV infeta células recetoras em que o vírus se possa fixar, como é o caso de macrófagos e certos linfócitos T. A reação do organismo à infeção viral ocorre em três fases: - Primoinfeção – proliferação rápida do vírus e diminuição de linfócitos T auxiliares; - Fase de latência – equilíbrio entre a proliferação de vírus e a destruição de linfócitos T auxiliares com o aumento da produção de anticorpos anti-HIV e de linfócitos T citotóxicos. - Fase de imunodeficiência (SIDA) – a carga viral aumenta, o número de linfócitos diminui drasticamente e, assim, o organismo fica sujeito a qualquer infeção.

Um vídeo explicativo das diferentes fases da infeção pelo HIV (vírus da SIDA)

Doenças e desequilíbrios - Doenças autoimunes

O timo, local onde se dá a maturação dos linfócitos T, funciona como um crivo: apenas deixa passar os linfócitos sem afinidade com os antigénios do próprio indivíduo (autoantigénios).

Quando este mecanismo não ocorre, o organismo reage contra os seus próprios componentes (organelos celulares, tipos de células, componentes de tecidos, etc). Exemplos de doenças causadas são as seguintes: diabetes insulinodependente, artrite reumatoide e esclerose em placas.

Um vídeo breve sobre doenças autoimunes.

Diabetes	A regulação da glicemia (concentração de glicose no sangue) é regulada por duas hormonas segregadas por células endócrinas das ilhotas de Langerhans no pâncreas, sendo uma delas a insulina. Cada célula possui recetores para a insulina, cujo aumento de concentração permite a entrada de glucose nas mesmas. A diabetes carateriza-se por uma hiperglicemia crónica (elevadas concentrações de glucose no sangue), e é dividida em dois tipos: - Diabetes tipo 1 – insulinodependente – resulta numa deficiência na produção de insulina, causada por uma destruição das células produtoras de insulina por parte de linfócitos T citotóxicos. - Diabetes tipo 2 – manifesta-se mais tardiamente e resulta no facto de os recetores nas células alvo da insulina diminuírem.
Artrite reumatoide	Carateriza-se pelas cartilagens das articulações pelo sistema imunitário
Esclerose em placas	Doença neurológica em que ocorre a destruição de componentes do sistema nervoso «em placas», ou seja, há destruição da substância branca dos centros nervosos (mielina, axónios e células nervosas) por linfócitos T ou mediadores químicos. Pode ocorrer devido a um «engano» dos linfócitos T, que confundem um antigénio viral com um antigénio do próprio organismo e atacam a mielina. A doença manifesta-se por crises que alternam com remissão, mas que podem deixar sequelas.

Exemplo da artrite reumatoide:

http://www.topnews.in/health/files/chronicautoimmune-disease.jpg

Doenças e desequilíbrios - Alergias

O sistema imunitário pode ter deficiências ou sofrer desregulações, o que pode tornar o indivíduo muito vulnerável a infeções ou conduzir a reações violentas contra o próprio ou contra elementos ambientais normalmente tolerados.

Alergias

Uma alergia é uma reação de defesa exagerada por parte do sistema imunitário. Corresponde a estados de hipersensibilidade imunitária, o que se traduz em reações exageradas contra antigénios específicos como ácaros, pó, pólen, esporos, produtos químicos e alimentares que, por desencadearem alergias, têm o nome de alergénicos.

http://intranet.tdmu.edu.ua/data/kafedra/internal/patologanatom/classes_stud/en/stomat/ptn/Pathomorphology/2-3/04_Pathomorph_immune_syst_(Stom_Pract).files/image037.png

Como se processa uma reação alérgica?

Fase de sensibilização	1. O alergénio (antigénio), após entrar no organismo, é captado por células apresentadoras, que ativam linfócitos T.
	2. Os linfócitos T produzem mediadores químicos que ativam linfócitos B, que se diferenciam em plasmócitos.
	3. Os plasmócitos sintetizam imunoglobulina E (IgE) (anticorpos).
	4. Os anticorpos ligam-se a várias células, incluindo mastócitos, que contêm histaminas.
Resposta secundária	1. O antigénio entra novamente no organismo.
	2. Forma-se um complexo anticorpo-antigénio e a histamina é libertada.
	3. A histamina provoca a dilatação dos vasos sanguíneos, provocando a saída de fluídos e edemas, aumenta a secreção de muco e causa a contração dos bronquíolos pulmonares.

Exemplo de reação alérgica ao pólen:

http://csls-text2.c.u-tokyo.ac.jp/images/fig/c_fig09_03.jpg

Podemos considerar diferentes tipos de reação alérgica, tais como:

- Hipersensibilidade imediata – manifesta-se imediatamente após o segundo contacto com o alergénico, devido à formação de anticorpos IgE no primeiro contacto. Ex: alergias respiratórias (asma e rinites), alergias cutâneas (urticárias e eczemas), alergias oftalmológicas e alergias digestivas.

- Hipersensibilidade tardia – demora mais de 12 horas para se desenvolver e é mediada por células e não por anticorpos, ou seja, os mediadores químicos libertados pelos linfócitos T vão produzir efeitos em células que manifestam a doença. Ex: lixívia, cosméticos, cimento, tintas e metais.

Memória imunitária e vacinação

A reação do sistema imunitário ao agente infeccioso varia conforma essa seja a primeira vez ou não que tem contacto com esse agente.

Comparação entre resposta primária e secundária:

http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/lectures/memory.jpg

Se tiver sido o primeiro contacto com o agente patogénico ocorre uma resposta imunitária primária: os linfócitos capazes de reconhecer esse antigénio são ativados, dando-se depois proliferação e diferenciação em células efetoras e em células de memória.

Se já for o segundo encontro com o antigénio ocorre uma resposta imunitária secundária, uma resposta mais rápida, intensa e de duração mais longa: as células de memória, armazenadas nos órgãos linfoides periféricos, ao serem estimuladas pelo antigénio específico, produzem mais células efetoras e mais células memória.

Ativação dos linfócitos T e B e diferenciação dos segundos em plasmócitos e células memória.

http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/lectures/1100361_026.jpg

O princípio de memória imunitária pode ser utilizado na imunização do organismo, utilizando vacinas.

Uma vacina clássica contém uma solução de agentes patogénicos mortos ou inativos, apenas o antigénio do agente infecioso ou mesmo apenas o determinante antigénico.

A vacina desencadeia uma resposta imunitária primária pelo que, se o organismo voltar a ser invadido pelo mesmo agente patogénico, desencadear-se-á uma resposta imunitária secundária.

Uma breve história das vacinas e a sua importância na erradicação de doenças.

Defesa específica – Imunidade adquirida – Terceira linha de defesa

Estes mecanismos vão sendo mobilizados enquanto a primeira e segunda linha de defesa atuam. Por ser dirigida especificamente contra certos organismos torna-se muito mais eficaz. Intervêm o sistema linfóide, constituído por órgãos linfóides e células efetoras (linfócitos).

Órgãos linfóides primários	Locais de diferenciação e maturação de linfócitos. Timo e medula vermelha dos ossos.
Órgãos linfóides secundários ou periféricos	Locais de circulação e armazenamento de células imunitárias. Baço, gânglios linfáticos, amígdalas, gânglios linfáticos abdominais e apêndice.

Orgãos linfóides no nosso corpo:

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Um antigénio é todo o componente molecular que desencadeia uma resposta imunitária específica. A maioria dos antigénios são proteínas ou polissacarídeos que se encontram na superfície externa de microrganismos invasores ou que são produzidos por estes, mas também podem ser pólen, parasitas, órgãos transplantados, desde que provoquem uma resposta imunitária do mesmo tipo.

As células efetoras na resposta imunitária específica são os linfócitos T e os linfócitos B, que derivam da especialização de percursores linfoides.

Percursor	Célula especializada
Megacariócito	Plaquetas
Eritroblasto	Hemácias
Percursor mieloide	Basófilo, Neutrófilo, Eosinófilo, Monócito
Percursor linfoide	Linfócito T (timo) e Linfócito B (medula óssea)

Função dos linfócitos T e B na resposta imunitária: imunidade mediada por células e imunidade humoral.

http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/lectures/49_17_cell-mediated_humor-L.jpg

No timo e na medula óssea os linfócitos completam o processo de amadurecimento, adquirindo moléculas membranares que funcionam como recetores, tornando-se células imunocompetentes.

Os linfócitos migram depois para a corrente sanguínea, tecidos e órgãos linfáticos, ou para o local do processo inflamatório, onde ocorre o contacto com o antigénio.

Uma resposta imunitária contempla os seguintes processos:

·       - Identificação/ Reconhecimento: as moléculas estranhas são identificadas pelos linfócitos que têm na sua superfície recetores;

·        - Reação: o sistema imunitário reage, preparando os agentes específicos que vão intervir no processo;

·        -  Ação: os agentes do sistema imunitário neutralizam ou destroem as células ou moléculas estranhas.

      A resposta imunitárias e as várias linhas de defesa:

http://joellezimprich.wikispaces.com/file/view/innate.jpg/126932215/innate.jpg

Uma caraterística do sistema imunitário é a sua capacidade de «memória». Assim, se já tivermos contraído uma determinada doença, já teremos adquirido linfócitos especializados no reconhecimento do vírus causador dessa doença, de forma que, se formos infetados uma segunda vez, o vírus será destruído ainda antes de se manifestar a doença, pois teremos adquirido imunidade. Existem diferentes tipos de imunidade.

Defesa não específica - imunidade inata

Neste tipo de mecanismos, a resposta é idêntica para agentes invasores diferentes, mesmo que não seja a primeira vez que o indivíduo é invadido pelo agente patogénico.

Primeira linha de defesa – barreiras físicas e químicas que impedem a entrada de seres estranhos

Pele	Primeira barreira química e mecânica. Na epiderme ocorrem células mortas, células especializadas na pigmentação e células que asseguram a imunidade cutânea.
Pelos das narinas	Primeira barreira para microrganismos do ar.
Mucosas	Segregam muco que impede que os microorganismos se fixem às células. Também contém células especializadas na imunidade.
Secreções e enzimas	As glândulas sebáceas, sudoríparas e lacrimais segregam substâncias tóxicas para muitas bactérias. Têm o mesmo efeito o ácido clorídrico do estômago e as enzimas do suco gástrico.

Segunda linha de defesa – utilizada quando os microorganismos ultrapassam a primeira barreira.

A segunda linha de defesa carateriza-se pela pela resposta inflamatória, resposta sistémica e cicatrização.

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Resposta inflamatória local e fagocitose	Visa inactivar ou destruir os agentes invasores. Histamina – produzida no tecido atingido pelos mastócitos (diferenciação dos basófilos), dilata os vasos sanguíneos e aumenta a sua permeabilidade. Quimiotaxia – migração direccional das células em resposta ao aumento da concentração de determinadas substâncias químicas no local afectado. Diapedese – os neutrófilos e monócitos, que depois se transformam em macrófagos, deformam-se e atravessam as paredes dos capilares, em direcção ao tecido infectado. Efeitos – edema (pelo aumento do fluido intersticial), rubor, calor (causados pelo maior afluxo sanguíneo) e dor (devido à distensão de tecidos e acção de substâncias químicas em terminações nervosas). Cicatrização – regeneração de alguns tecidos através de mitoses.
Resposta sistémica	Resposta que não se fica pelo local infectado, envolve todo o corpo. Febre – aumento da temperatura corporal devido à produção de substâncias tóxicas por agentes patogénicos e de pirogénios, produzidos por glóbulos brancos. Leucócitos – aumento do número em circulação.
Interferões	Proteínas produzidas por células infectadas ou linfócitos T activados, que se ligam à membrana citoplasmática de células e as estimulam a produzirem proteínas antivirais, que inibem a replicação do ácido nucleico do vírus.

Na imagem seguinte encontra-se um esquema da resposta inflamatória:

https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiPXg_F_O8zHE5L6FM4upyV8sRoOBM-T2wC5lMupZlBSbfIirdbY38h21RG8v8P5iwKQu5ZSctGqphVoE2xFKJlfOAwd5h_iaryXrcSQyzFdvL5j8WqbWO9dyfWCUY_sJfGkZ9Pt0QGXN8/s1600/Sem+t%25C3%25ADtulo5.jpg

Resumindo a segunda linha de defesa numa única imagem:

http://image.slidesharecdn.com/2-defesasnoespecficas-150208143457-conversion-gate02/95/defesas-no-especficas-15-638.jpg?cb=1423410098

Os leucócitos e a resposta imunitária

A função dos leucócitos e a defesa do organismo. Estes apresentam algumas caraterísticas que os tornam essenciais na resposta imunitária:

- Capacidade de circulação no sangue e fora dele, através da linfa intersticial;

- Capacidade de deformação e penetração entre as células da parede dos vasos capilares;

- Recetores à superfície da membrana (glicoproteínas específicas).

Quais os tipos de leucócitos que existem?

Nome	Descrição		Funções
Leucócitos ou glóbulos brancos	Granulares (Possuem núcleo multilobado e grânulos citoplasmáticos específicos)	Eosinófilos ou Acidófilos	Fagocitose
		Neutrófilos	Fagocitose
		Basófilos	Resposta inflamatória
	Agranulares ou hialinos (Não se observam grânulos no citoplasma)	Linfócitos (B e T)	Papel fundamental na imunidade
		Monócitos	Fagocitose Diferenciam-se em Macrófagos

Tipos de leucócitos: linfócito, monócito, eosinófilo, basófilo e neutrófilo.

http://blogmedicina.com/wp-content/uploads/2012/12/preview_html_57433fd8_thumb.jpg

A fagocitose consiste na ingestão de um agente patogénico numa vesícula digestiva, que é depois ingerido com a ajuda de enzimas digestivas presentes nos lisossomas do leucócito. Os leucócitos com capacidade fagocitária têm o nome de fagócitos.

Um vídeo muito breve sobre a fagocitose.

Imunidade: inata e adaptativa

Como já foi referido, a imunidade consiste no conjunto de processos fisiológicos que permitem reconhecer, neutralizar e eliminar corpos estranhos ou anormais ao nosso organismo. Podem-se definir duas imunidades:

- Imunidade inata: presente em todos os seres multicelulares, consiste num conjunto de mecanismos de defesa não específica, cuja ação é geral e efetuada sempre do mesmo modo; apresenta uma primeira linha de defesa, de barreira física e química, e uma segunda linha, que atua após a entrada do agente estranho;

- Imunidade adaptativa: pertence apenas aos vertebrados, e é resultante de processos evolutivos, e que consiste numa defesa específica, de reconhecimento do corpo estranho, através de interações entre moléculas do agente e recetores das membranas celulares.

Estes mecanismos permitem responder à identificação de agentes estranhos no organismo e estão envolvidos na sua eliminação e também na eliminação de células alteradas ou envelhecidas.

Comparando as duas imunidades:

http://blogelseviersaude.elsevier.com.br/wp-content/uploads/2013/07/Robbins-Patologia-Basica-Imagem-do-Livro-2.jpg

Reprodução nos Vírus e nas Bactérias

A grande diferença entre a reprodução viral e a reprodução bacteriana é a primeira ser dependente de células de um organismo hospedeiro para ocorrer, enquanto a segunda é autónoma.

Reprodução nos vírus

A reprodução viral ocorre apenas em células hospedeiras, quer estas sejam procariotas ou eucariotas. Os vírus utilizam organelos, enzimas e reservas bioquímicas da célula hospedeira para produzirem proteínas e ácidos nucleicos virais, que darão origem a novos vírus e podem levar à destruição da célula do organismo hospedeiro.

http://www.godisourfortress.com/science/wp-content/uploads/2012/04/chickenpox1.jpg

O processo de reprodução viral funciona da seguinte forma:

- O invólucro viral liga-se a recetores. As glicoproteínas do invólucro glicoproteico são reconhecidas e o conteúdo (a cápside e o DNA) penetram no interior da célula.

- O DNA viral é replicado e transcrito dentro do núcleo da célula hospedeira.

- O mRNA viral é traduzido num ribossoma da célula hospedeira, formando-se proteínas virais.

- O DNA viral e as proteínas virais organizam-se no citoplasma, obtendo-se um novo vírus, que pode agora abandonar a célula.

Para vírus com RNA em vez de DNA o processo difere.

Mais um pequeno vídeo, que explica como o vírus da gripe nos «utiliza como fábricas» na sua reprodução.

Reprodução nas bactérias

A reprodução nas bactérias é independente de outros seres e dá-se por divisão binária.

O DNA replica-se, a membrana celular começa a dividir a célula em duas, contendo, cada uma, a mesma quantidade de DNA. Ocorre a divisão do citoplasma. Finalmente, forma-se uma parede celular entre as duas membranas celulares. Estas duas células filha irão crescer e, mais uma vez, voltarão a dividir-se e assim sucessivamente.

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Vírus e Bactérias, que diferenças?

Embora ambos possam ser considerados agentes patogénicos, os vírus e as bactérias são seres muito diferentes entre si. Veja-se o seguinte quadro que sintetiza algumas dessas diferenças.

Vírus	Bactérias
Seres acelulares	Células procariotas
Possuem DNA ou RNA, protegido por uma camada proteica, a cápside	Possuem nucleoide (DNA circular não rodeado por invólucro) e algumas possuem também plasmídeos (DNA em anel)
Alguns apresentam um invólucro externo	Não possui organelos celulares
São dependentes de outras células para se reproduzirem e realizarem o seu metabolismo – parasitas intracelulares	São independentes na realização do metabolismo e reprodução.

Assim, enquanto o vírus é constituído apenas por uma cápside, um invólucro proteico, que envolve o ácido nucleico, podendo ter, ou não, um invólucro externo, as bactérias, sendo células procariotas, embora não possuam organelos celulares, contêm outras estruturas que lhes permitem ser independentes em termos metabólicos e reprodutivos.

Na imagem seguinte, observa-se a constituição de um vírus: o invólucro proteico, a cápside, protege o material genético. Existe ainda uma invólucro externo, com glicoproteínas.

http://chemistry.illinoisstate.edu/slweldo/keyForHIV/dreyfus/microbio3852.jpg

Como se referiu, as bactérias são mais complexas. Aqui se apresentam os seus componentes:

Componentes	Características
Cápsula bacteriana	Tem um aspeto gelatinoso, é rica em glícidos e moléculas proteicas. Tem função protetora e de defesa em relação a anticorpos, vírus e células fagocitárias.
Parede celular	Estrutura rígida composta por polissacarídeos e polipeptídeos. Confere forma à célula.
Flagelos	Auxilia o movimento.
Pili e Fímbrias	Estruturas proteicas, tubulosas e numerosas, muito mais curtas e finas que os flagelos. Permitem a fixação ao substrato e as trocas com o exterior.
Membrana celular	Membrana celular típica. Pode formar invaginações para o interior das células e constituir mesossomas, que contêm enzimas relacionadas com a respiração.
Material genético	Nucleoide de DNA circular, podendo também conter plasmídeos de DNA em anel.
Ribossomas e inclusões	No citoplasma, encontram-se ribossomas e grânulos de reserva.

Nesta imagem, podem-se observar os vários componentes da célula procariota.

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Imunidade e Controlo de Doenças

Neste novo período, o tema da unidade é «Imunidade e Controlo de Doenças». O objetivo desta unidade é compreender como é possível sobrevivermos num mundo em que estamos rodeados de microrganismos causadores de doenças. A respostas encontra-se no nosso sistema imunitário.

O que é o Sistema Imunitário?

O sistema imunitário é o conjunto de órgãos, tecidos e células que nos defendem de agentes estranhos.

A que se referem os agentes estranhos/ agentes patogénicos?

Agentes patogénicos são agentes causadores de doenças, tais como, bactérias, vírus, fungos, protistas. Os agentes patogénicos têm a capacidade de ultrapassar as barreiras do nosso organismo, penetrando os nossos tecidos, resistir às tentativas de neutralização por parte do sistema imunitário, multiplicar-se dentro do nosso organismo e destruir tecidos do mesmo.

Os microrganismos patogénicos propagam-se através da água, ar, alimentos, por contacto, por picada de animais e a através de relações sexuais.

Seguidamente encontra-se um pequeno vídeo, que faz uma breve introdução ao sistema imunitário.